PEMERIKSAAN SPUTUM
Pemeriksaan ini terutama
ditujukan untuk pemeriksaan terhadap Mycobacterium penyebab infeksi paru dan
kuman-kuman lain. Pemeriksaan ini dilakukan tergantung dari gejala klinisnya
atau menurut permintaan dari dokter yang mengirim.
Kuman-kuman lain yang mungkin
dapat dijumpai dalam sputum :
-
Pnemococcus
-
Coccus
Gram (+) lain
-
Bacillus
anthraxis
-
Klebsiella
pneumonia
Prosedur
pemeriksaan :
§
Dengan
menggunakan ose, sputum ditanam pada media BAP, ink. 370C 24 jam
suasana aerobic
§
Kemudian
sisa sputum dikonsentrasikan secara asam / basa, sebagai berikut :
-
Cara
basa :
Ø
Sputum
ditambah NaOH 4% sama banyak, kemudian ditambah indikator Phenol Red 0,004%,
dikocok 5-10 menit, selanjutnya diink. 370C ½ - 1 jam.
Ø
Dicentrifuge
2500-3000 rpm selama 20 – 30 menit
Ø
Supernatan
dibuang, sisakan ½ - 1 ml dari sedimen
Ø
Dari
sedimen kemudian dilakukan : pengecatan ZN, penanaman pada media LJ dan
percobaan hewan
Ø
Penanaman
pada media LJ diink. 370C suasana aerobic selama 8 minggu dan setiap
3 hari diperiksa, apakah ada pertumbuhan. Bila kurang dari 1 minggu ada
pertumbuhan kuman, maka dicurigai kuman Mycobacterium saprophiticus
Ø
Bila
pada media LJ ada pertumbuhan koloni, kemudian ditanam pada media cair,
selanjutnya diteruskan dengan pemeriksaan :
·
Cordformation
tes
·
Niasin
tes
·
Hewan
percobaan
Ø
Bila
pada BAP ada pertumbuhan, maka dibuat sediaan dan di cat Gram serta ZN.
Ø
Dari
hasil pengecatan dapat dilanjutkan pemeriksaan sesuai dengan kuman yang
ditemukan, misalnya : kokus Gram positif atau Gram negatif atau batang Gram
positif atau batang Gram negatif, pemeriksaan selanjutnya sama seperti
pemeriksaan pada darah kultur
-
Cara
Asam :
Ø
Beri
HCl 1N 10% tetes demi tetes dengan pipet steril sampai warna purple
Ø
Langkah
selanjutnya sama dengan diatas.
Kultur Sputum / Cairan Lambung
Metode Kultur M. tuberculosae
(Ogawa methode)
1. Pre
– treatment :
1.
1
bagian sputum + 4 bagian NaOH 4%
2.
Taruh
pada inkubator 370C (15-20 menit)
3.
Ambil
dari inkubator à diaduk dengan pipet
perlahan-lahan hingga homogen
2. Inokulasi
1.
Tanam
0,1 ml pada 2 tabung media Ogawa
2.
Tutup
harus dirapatkan. Bila tutup dari kapas/kertas tella harus parafine setelah
permukaan media kering (24 jam)
3.
Kemudian
dimasukkan inkubator 370C, tidak boleh kurang dari 4 minggu dan
diteuskan sampai 8 minggu
4. Inkubasi
1.
Letakkan
didalam inkubator 370C
2.
Tutup
harus dirapatkan. Bila tutup dari kapas/kertas tella harus diparafine setelah
permukaan media kering (24 jam)
3.
Kemudian
dimasukkan inkubator 370C, tidak boleh kurang dari 4 minggu dan
diteruskan sampai 8 minggu
5. Pembacaan
a.
Bila
kultur tumbuh dalam 7 hari adalah Rapid growers
b.
Bila
4 minggu adalah Slow Growers
c.
Bila
koloni tumbuh 7 hari dan setelah 4 minggu check dengan jalan dibuat preparat
dan diwarnai dengan ZN
d.
Bila
koloni tidak terlihat dalam waktu 8 minggu dinyatakan kultur negatif
Penilaian dan pelaporan
(Recording and Reporting)
Pertumbuhan M. tuberculosisi tampak
setelah 3 – 4 minggu. Koloni terdapat pigmen kuning, kering, permukaan tidak
merata, dan tepinya tidak rata. Koloni yang demikian dinamakan Eugonic. Terkadang koloni lembab dan
tidak berpigmen, dinamakan disgonic.
Laporan pertumbuhan :
(-)
/ negatif : 1 – 200 koloni
(+1) : 200 – 500 koloni (½
permukaan media tertutup oleh pertumbuhan)
(+3) : 500 – 2000 koloni ( ¾
permukaan media tertutup oleh pertumbuhan)
(+4) : 2000 koloni (seluruh
permukaan media tertutup oleh pertumbuhan)
Contaminasi rate :
C1+ : ¼ dari medium contaminasi
C2+ : ½ dari medium contaminasi
C3+ : ¾ dari medium contaminasi
C4+ : seluruh permukaan medium
contaminasi
LQ : medium mencair
Media Kultur
MGIT (Mycobacterium Groeth
Incubator Tube)
Cara kerja :
Persiapan spesimen : (homogenisasi, dekontaminasi dan
dekonsentrasi)
Sputum 3 ml + larutan NaOH &
NaCl 3 ml + buffer phospat sampai 15 ml à kocokà
biarkan 15 – 20 menit pada suhu
kamar à centrifuge 3000 rpm, 15 menit à ambil supernatannya + buffer fosfat 0,5 ml.
Penyiapan tabung MGIT :
Tabung MGIT + PANTA o,1 ml + OADC
0,5 ml + spesimen No. 5 sebanyak 0,5 ml à inkubasi
370C à baca tiap hari, mulai hari ke – II, bandingkan
dengan kontrol positif dan negatif.
Reagen TB – DOT
Reagensia
berisi :
1.
Larutan
dapar pelarut :
100 ml
2.
Larutan
dapar pencuci serum :
100 ml
3.
Larutan
dapar pencuci konjugat :
100 ml
4.
Larutan
dapar substrat :
50 ml
5.
H2O2 :
500 µl
6.
Serum
kontrol positif (dalam bentuk terliofilisasi)
7.
Serum
kontrol negatif (dalam bentuk terliofilisasi)
8.
Kromogen
(larutan aminoathylcarbozole) :
90 µl
9.
Konjugat
(goat – AH IgG F(ab)2) :
25 µl
10.
Susu
krim :
5 kantong
11.
Gelatine :
10 bungkus
12.
Kertas
Antigen :
50 biji
13.
Pelarut
serum kontrol :
1000 µl
Prosedur kerja :
1.
Persiapan
serum kontrol :
Serum kontrol dalam tabung + 150 µl
pelarut serum kontrol à campur dengan baik (dengan
pipet) sampai larut à bagi menjadi 5 tabung à simpan dalam frezer (kalau mungkin -200C)
Cairkan
serum kontrol bila akan digunakan, serum kontrol yang sudah dicairkan tidak
bisa digunakan lagi.
2.
Persiapan
larutan kerja :
§
Pelarut
skim : 20 cc larutan dapar pelarut + 40 ml aquades + 1 kantong susu skim à pelarut skim ini digunan untuk mengencerkan serum
dan konjugate.
§
Larutan
kerja pencuci serum : 12,5 ml larutan dapar pencuci serum + 12,5 ml aquadest +
1 bungkus gelatin à biarkan sampai gelatin larut
§
Larutan
kerja pencuci konjugate : 12,5 ml larutan dapar pencuci konjugate + 12,5 ml
aquadest + 1 bungkus gelati à biarkan sampai gelatin larut
§
Larutan
konjugate : .... ml pelarut skim + .... µl konjugate
§
Sunstrat
: 7090 µl larutan dapar substrate + 10 µl kromogen + 7 µl H2O2 2%
à substrat ini disiapkan 10 menit sebelum digunakan
§
Cara
mengencerkan serum :
o Untuk TB dalam paru dan serum
kontrol : 10 µl serum + 3190 µl pelarut skim à pengenceran 1/320
o Untuk TB diluar paru : 10 µl
serum + 2590 µl pelarut skim à pengenceran 1/260
Cara pemeriksaan :
a)
Masukkan
kertas antigen ke dalam tray (dengan bagian yang ada tandanya diletakkan
diatas)
b)
Isi
tray dengan 900 µl pelarut skim
c)
Tambahkan
100 µl serum penderita / kontrol pengenceran 1/320 atau 1/260 dan campur dengan
baik sehingga pengenceran akhir menjadi 1/3200 atau 1/2600. Untuk blanko tidak
perlu ditambah serum
d)
Inkubasi
diatas sheker selama 2 jam pada suhu ruang dengan kecepatan 60 rpm.
e)
Buang
sisa reagen dengan cara diisap dengan pipet sampai habis
f)
Isi
tray dengan larutan kerja pencuci serum sebanyak 1 ml à diamkan selama 5 menit, kemudian buang sisa
reagennya sampai habis
g)
Tambahkan
larutan konjugate 250 µl à inkubasi diatas sheker selama 1
jam pada suhu ruang à buang sisa reagen sampai habis
h)
Isi
tray dengan 0,5 ml larutan kerja pencuci konjugate à diamkan selama 5 menit, kemudian buang sisa
reagennya sampai habis
i)
Ulang
(h) 2 kali lagi, kemudian buang sisa reagennya sampai habis
j)
Isi
tray dengan larutan substrat sebanyak 250 µl à diamkan 5-10 menit ditempat yang
gelap
k)
Tambahkan
aquades à kemudian buang dengan pipet à tambahkan aquadest lagi à buang sampai habis
l)
Baca
segera hasilnya selagi masih basah
Pembacaan :
§
Positif
: bila pada kertas terdapat
bulatan antigen yang berwarna merah
§
Negatif : bila kertas antigen tetap bersih atau
tepat lingkaran antigen berwarna merah, sedangkan tengahnya tetap putih
Keabsahan tes :
Hasil tes dikatakan absah, bila
kontrol positif memberi hasil positif, sedangkan kontrol negatif dan blanko
memberi hasil negatif. Bila ada penyimpangan dari hal tersebut diatas, maka
seri pemeriksaan tersebut perlu diulang
Karakteristik uji TB-DOT
Dari hasil penelitian Handojo (media
IDI, 1996,21:17-21) didapatkan hasil berikut :
§
Sensitivitas
diagnostik tes : 88,9% untuk TB paru dan 87,5% untuk TB diluar paru
§
Spesifisitas
diagnostik tes : 87,5%
§
Efisiensi
diagnostik tes : 88,2% untuk TB paru dan 87,5% untuk TB diluar paru
§
Nilai
ramal positif diagnostik tes : 88,9% untuk TB paru dan 85,7% untuk TB diluar
paru
§
Nilai
ramal negatif tes : 87,5% untuk TB paru dan 89,1% untuk TB diluar paru
Pengaruh vaksinasi BCG :
Tak bermakna sampai 3 bulan pasca
vaksinasi, setelah 3 bulan pengaruhnya pada hasil TB-DOT tidak ada.
Negatif
semu (false negatif) dapat disebabkan oleh :
1) Antigen TB dalam serum penderita
TB paru dengan dahak positif yang amat parah
2)
Penggunaan
obat-obatan immunosupresif (perlu dihentikan dulu selama 3 minggu)
3)
Penanganan
dan pengiriman serum yang kurang baik
4)
Immunodefisiensi
humoral (DM tak terwat)
5) Malnutrisi yang amat berat
Positif
semu (false positif) dapat disebabkan oleh :
1) Penyakit lepra, terutama tipe L
2) Beberapa jenis tumor paru
Perhatian :
Bila semua serum kontrol dan blanko
memberi hasil positif, mungkin disebabkan oleh karena pencucian kurang baik
atau pencemaran reagensia. Bila semua serum kontrol memberi hasil negatif,
mungkin reagensia sudah rusak (khususnya substratnya).
DIAGRAM
PEMERIKSAAN SPUTUM
S P U T U M
Konsentrasi
LJ
Ink.
4 minggu (lihat tiap 3 hr 370C)
Koloni (-) Jika 3 hr (<10hr)
Cat Gram Koloni
(+)
Curiga
Mycobacterium non
Patogen
(saprofit)
Cordformation tes
Niasin tes
Hewan percobaan tanam pada Broth
(untuk virulensi tes)
Catatan
:
Pemeriksaan
sputum biasanya dimaksudkan untuk Mycobacterium, infeksi paru bisa juga oleh
kuman lain tergantung gejala klinis atau permintaan dokter.
Misalnya
:
Ø
Diplococcus
pnumoniae
Ø
Coccus
Gram positif
Ø
Bacillus
anthraxis
Ø
Klebsiella
pneumoniae
Bila
ada dugaan kuma tersebut, maka dilakukan pemeriksaan bakteriologi sesuai dengan
prosedur.
Beberapa
Skala yang digunakan dalam pembacaan BTA
1.
Bronkhost
Kraan (1949) :
Dalam skala dibedakan 5 tingkatan
jymlah BTA. Menurut penemmunya skala ini dianggap dapat pula mencerminkan
proses tuberkulosis dalam paru-paru penderita.
Skala
|
Jumlah BTA
|
Proses Tuberkulosis
|
B +1
|
40 per sediaan
|
Tidak aktif
|
B +2
|
20 per 10 lp
|
Tidak ada kaverna/ada kaverna
kecil saja
|
B +3
|
60 per 10 lp
|
Kemungkinan besar ada kaverna
|
B +4
|
120 per 10 lp
|
Kemungkinan ada kaverna besar
dan aktif
|
B +5
|
>120 / lp
|
Hampir pasti ada kaverna dan
aktif
|
2.
Skala
Gaffky :
Skala ini menunjukkan hasil
pemeriksaan semi kuantitatif yang biasa digunakan di Jepang. Gaffky membagi
skala dalam 10 tingkat.
Skala
|
Jumlah BTA yang ditemukan
|
0
|
Tidak ditemukan adanya BTA
|
1
|
1 – 4 BTA dalam seluruh sediaan
|
2
|
Dari beberapa lp, ada 1 BTA
|
3
|
Pada tiap lp, ada 1 BTA
|
4
|
2 – 4 BTA per lp
|
5
|
4 – 6 BTA per lp
|
6
|
7 – 12 BTA per lp
|
7
|
13 – 25 BTA per lp
|
8
|
26 – 50 BTA per lp
|
9
|
50 – 100 BTA per lp
|
10
|
>100 BTA per lp
|
3.
Skala
IUAT (International Union Against Tuberculosis)
Skala ini digunakan bila
menggunakan cara pembacaan sediaan menurut metode IUAT yaitu telah diperiksa
seluruh sediaan melalui 2 jalur pergeseran pemeriksaan.
Skala
|
Jumlah
BTA yang ditemukan
|
Negatif
|
Tidak ditemukan adanya BTA
|
Ragu – ragu
|
1 – 9 BTA per 300 lp
|
Positif +1
|
10 – 29 BTA per 300 lp
|
Positif +2
|
10 – 100 BTA per 100 lp
|
Positif +3
|
1 BTA per lp
|
4.
Skala
IUATLD (International Union Against Tuberculosis Lung Desease) :
Skala
ini menurut Depkes RI Jakarta tahun 2000. Pembacaan hasil pemeriksaan sediaan
dahak dilakukan dengan menggunakan skala IUATLD sebagai berikut :
Skala
|
Jumlah BTA yang ditemukan
|
Negatif
|
Tidak
ditemukan BTA dalam 100 lp
|
Ditulis
jumlah kuman yang ditemukan
|
Ditemukan
1 – 9 BTA per 100 lp
|
+1
|
Ditemukan
10 – 99 BTA per 100 lp
|
+2
|
Ditemukan
1 – 10 BTA per lp
|
+3
|
Ditemukan
> 10 BTA per lp
|
5.
Kode
WHO
Bila
menggunakan kode WHO untuk menentukan jumlah BTA, maka harus digunakan cara
pemeriksaan sediaan seperti dianjurkan oleh WHO.
Pembacaan dianggap selesai bila telah diperiksa
seluruh sediaan melalui 4 jalur pergeseran pemeriksaan.
Kode
|
Jumlah BTA yang ditemukan
|
0
|
Tidak
ditemukan adanya BTA
|
1
|
1 BTA
per sediaan
|
2
|
2 BTA
per sediaan
|
3
|
3 BTA
per sediaan
|
4
|
4 BTA
per sediaan
|
5
|
5 BTA
per sediaan
|
6
|
6 –
24 BTA per sediaan
|
7
|
25
atau lebih BTA per sediaan
|
8
|
25
atau lebih BTA per jalur pemeriksaan
|
9
|
Ditemukan
banyak BTA per lapangan penglihatan
|
6.
Skala
NTA (National Tuberculosis Association of United State of America)
Skala ini digunakan khusus untuk melaporkan hasil
pemeriksaan sediaan yang diwarnai dengan pewarnaan fluorochrome, tetapi boleh
juga digunakan untuk sediaan yang diwarnai dengan pewarnaan baku. Tidak ada
metode pembacaan sediaan tertentu yang harus diikuti pada penggunaan skala ini,
jadi boleh digunakan cara pembacaan sediaan menurut metode WHO.
Skala
|
Jumlah BTA yang ditemukan
|
Tidak ditemukan BTA
|
0
|
Laporkan jumlah BTA yang ditemukan dan minta
spesimen ulang
|
1 – 2 BTA per sediaan
|
Jarang (+)
|
3 – 9 BTA per sediaan
|
Sedikit (++)
|
10 atau lebih per lapangan
|
Banyak (+++)
|
1 BTA atau lebih per lapangan penglihatan
|
7.
Skala
ALA (American Lung Association)
Jumlah Kuman
|
Laporan
|
0
|
Tidak ada BTA
|
1
– 2 per slide
|
Dilaporkan jumlah kuman dan dilakukan pemeriksaan
ulang
|
3
– 9 per slide
|
Jarang atau (+1)
|
10 atau lebih per slide
|
Sedikit atau (+2)
|
1 atau lebih per lapang pandang
|
Banyak (+3)
|
1.
Kudoh
Medium (TBC)
§ 
Monopotassium fosfate 2 g
Monopotassium fosfate 2 g
§ MgSO4 -
§ Magnesium
citrate 0,1 g
§ Sodium
glutamat 0,5 g
§ 
Asparagine - panasi 1000C,
30 menit
Asparagine - panasi 1000C,
30 menit
§ Destilled
water 100
ml
§ Glycerol 4 ml
§ Egg
homogenate 200 ml
§ Malachite
green 2% 4 ml
Inspissatie 900C selama 1 jam
2.
Ogawa
Medium
§ Monopotassium
phospat 3 g
§ MgSO4 -
§ Magnesium
citrate -
§ Sodium
glutamat 1 g
§ Asparagine -
§ Glycerol 6 ml
§ Aquadest
100 ml
§ Egg
homogenate 200 ml
§ Malachite
green 6
ml
Inspissate 900C selama 1 jam
3.
Konsentrasi
a. - X cc
sputum + X cc NaOH 4% + 0,004% Phenol Red à kocok 5-10 menit à eramkan 370C selama ½ -
1 jam
-
Beri tetes demi tetes HCl 1 N 10% dengan pipet steril sampai warna
purple à centrifuge
2500 – 3000 rpm selama 20
– 30 menit
-
pipet supernatan à sisihkan ½ - 1 cm dari sedimen
-
sedimen : di cat à ditanam à percobaan
b. X cc sputum + X cc NaOH 4% à shaker
10 – 15 menit à eramkan 15 – 30 menit àcentrifuge
2500-3000 rpm selama 15-20 menit à
supernatan dibuang à beri 1 tetes phenol red sebagai indikator
à
lakukan netralisasi dari sediment dengan HCl 1N tetes demi tetes sampai warna
purple.
c. Konsentrasi dengan H2SO4
4%
1 cc sputum + 5 cc H2SO4
4% à Shaker
15 menit (secara merata) à centrifuge 2500-3000 rpm, selama 15-20 menit à buang
supernatan à sedimen dicuci dengan PZ steril sebanyak 5 cc à
centrifuge 2500 – 3000 rpm, selama 15-20 menit à buang supernatan à sedimen dicuci dengan PZ steril sebanyak 5 cc à
centrifuge 2500-3000 rpm, selama 15-20 menit à supernatan dibuang à sedimen diolah
4.
Processing
sputum
NaOH 4% -
swab masukkan sputum (goyang-goyang) à masukkan NaOH 4% (= 4 ml) à tanam
pada medium
